Геномныя паслядоўнасці большасці вірусаў вядомыя.Зонды нуклеінавых кіслот, якія ўяўляюць сабой кароткія сегменты ДНК, прызначаныя для гібрыдызацыі з камплементарнымі сегментамі віруснай ДНК або РНК.Палімеразнай ланцуговая рэакцыя (ПЦР) - больш эфектыўны метад выяўлення вірусаў.Нядаўна былі распрацаваны высокапрадукцыйныя метады дыягностыкі.
А. Методыка гібрыдызацыі нуклеінавых кіслот
Гібрыдызацыя нуклеінавых кіслот, у асноўным уключаючы Саўзерн-блот (Паўднёвы) і Норзерн-блот (Паўночны), з'яўляецца новым метадам, які хутка развіваецца ў галіне дыягностыкі вірусаў.Сэнс аналізу гібрыдызацыі заключаецца ў выкарыстанні кароткіх сегментаў ДНК (званых «зондам»), прызначаных для гібрыдызацыі з камплементарнымі сегментамі віруснай ДНК або РНК.Пры награванні або шчолачнай апрацоўцы двухцепочечная ДНК або РНК-мішэнь падзяляюцца на адзінкавыя ланцугі, а затым імабілізуюцца на цвёрдай падстаўцы.Пасля гэтага зонд дадаецца і гібрыдызуецца з ДНК або РНК-мішэнню.Паколькі зонд пазначаны ізатопам або нерадыеактыўным нуклідам, мэтавую ДНК або РНК можна выявіць з дапамогай аўтарыяграфіі або сістэмы біятын-авідын.Паколькі большасць вірусных геномаў былі кланаваныя і секвенированы, іх можна выявіць, выкарыстоўваючы вірус-спецыфічныя паслядоўнасці ў якасці зондаў ва ўзоры.У цяперашні час метады гібрыдызацыі ўключаюць: дот-блот, гібрыдызацыю in situ ў клетках, ДНК-блот (ДНК) (Саўзерн-блот) і РНК-блот (РНК) (Норзерн-блот).
Тэхналогія B.PCR
У апошнія гады на аснове ПЦР была распрацавана серыя метадаў ампліфікацыі нуклеінавых кіслот in vitro для тэставання неадчувальных або некультывавальных вірусаў.ПЦР - гэта метад, які можа сінтэзаваць спецыфічную паслядоўнасць ДНК з дапамогай палімеразнай рэакцыі in vitro.Працэс ПЦР уключае тэрмічны цыкл з трох этапаў: дэнатурацыя, адпал і падаўжэнне. Пры высокай тэмпературы (93℃~95℃) двухцепочечная ДНК раздзяляецца на дзве адзінкавыя ланцугі ДНК;затым пры нізкай тэмпературы (37 ℃ ~ 60 ℃) два сінтэзаваных нуклеатыдных праймера адпальваюцца з камплементарнымі сегментамі ДНК;у той час як пры адпаведнай тэмпературы для фермента Taq (72 ℃) сінтэз новых ланцугоў ДНК пачынаецца з 3'-канца праймера з выкарыстаннем камплементарнай ДНК у якасці матрыц і адзінкавых нуклеатыдаў у якасці матэрыялаў.Такім чынам, пасля кожнага цыклу адзін ланцужок ДНК можа быць узмацнены ў два ланцугі.Пры паўтарэнні гэтага працэсу кожны ланцуг ДНК, сінтэзаваны ў адным цыкле, можа быць выкарыстаны ў якасці шаблону ў наступным цыкле, а колькасць ланцугоў ДНК падвойваецца ў кожным цыкле, што азначае, што выпрацоўка ПЦР узмацняецца з хуткасцю 2n log.Пасля 25-30 цыклаў выпрацоўка ПЦР вызначаецца з дапамогай электрафарэзу, і спецыфічныя прадукты ДНК можна назіраць пад ультрафіялетавым святлом (254 нм).Дзякуючы спецыфічнасці, адчувальнасці і зручнасці метад ПЦР быў прыняты ў клінічнай дыягностыцы многіх вірусных інфекцый, такіх як ВГС, ВІЧ, ЦМВ і ВПЧ.Паколькі ПЦР вельмі адчувальная, яна можа выяўляць ДНК віруса на ўзроўні fg, аперацыю трэба праводзіць вельмі асцярожна, каб пазбегнуць ілжывых станоўчых вынікаў.Акрамя таго, станоўчы вынік тэсту на нуклеінавыя кіслаты не азначае, што ва ўзоры ёсць жывы інфекцыйны вірус.
Дзякуючы шырокаму прымяненню метаду ПЦР, новыя метады і метады распрацоўваюцца на аснове тэхнікі ПЦР для розных мэтаў тэставання.Напрыклад, колькасная ПЦР у рэальным часе можа выявіць вірусную нагрузку;ПЦР in situ выкарыстоўваецца для ідэнтыфікацыі віруснай інфекцыі ў тканінах або клетках;Укладзеная ПЦР можа павялічыць спецыфічнасць ПЦР.Сярод іх колькасная ПЦР у рэальным часе была распрацавана больш хутка.Шмат новых метадаў, такіх як зонд для гідролізу TaqMan, зонд для гібрыдызацыі і малекулярны зонд-маяк, былі аб'яднаны ў метад колькаснай ПЦР у рэальным часе, які шырока выкарыстоўваецца ў клінічных даследаваннях.Акрамя дакладнай ідэнтыфікацыі віруснай нагрузкі ў цялеснай вадкасці пацыента, гэты метад таксама можа быць выкарыстаны для выяўлення ўстойлівага да лекаў мутанта.Такім чынам, колькасная ПЦР у рэальным часе ў асноўным выкарыстоўваецца для ацэнкі лячэбнага эфекту і назірання за пераноснасцю лекаў.
C. Высокапрадукцыйнае выяўленне вірусных нуклеінавых кіслот
Каб задаволіць патрэбу ў хуткай дыягностыцы новых інфекцыйных захворванняў, былі створаны розныя высокапрадукцыйныя метады выяўлення, такія як ДНК-чыпы (ДНК).Для ДНК-чыпаў сінтэзуюцца спецыфічныя зонды, якія прымацоўваюцца да невялікіх крэмніевых чыпаў з вельмі высокай шчыльнасцю, каб утварыць мікрачып ДНК-зондаў (ДНК), які можна гібрыдызаваць з узорам.Сігнал гібрыдызацыі можа быць адлюстраваны канфакальным мікраскопам або лазерным сканарам і апрацаваны ў далейшым камп'ютэрам, і можа быць атрыманы велізарны набор дадзеных, якія тычацца розных генаў.Ёсць два віды ДНК-чыпаў.«Чып сінтэзу» заключаецца ў наступным: канкрэтныя алігануклеатыды сінтэзуюцца непасрэдна на чыпах.Іншы - чып пула ДНК.Кланаваныя гены або прадукты ПЦР упарадкавана надрукаваны на слайдзе.Перавагай тэхналогіі ДНК-чыпаў з'яўляецца адначасовае выяўленне велізарнай колькасці паслядоўнасцяў ДНК.Апошняя версія чыпа для выяўлення патагенаў можа ідэнтыфікаваць больш за 1700 вірусаў чалавека адначасова.Тэхналогія ДНК-чыпаў вырашыла праблемы традыцыйных метадаў гібрыдызацыі нуклеінавых кіслот і мае вельмі шырокае прымяненне ў дыягностыцы вірусаў і эпідэміялагічных даследаваннях.
Час публікацыі: 23 снежня 2020 г